细胞治疗近年来取得飞速发展，并在一系列肿瘤治疗中取得令人瞩目的疗效。例如，靶向B细胞抗原CD19的嵌CAR-T细胞，对某些复发和/或难治性的B细胞恶性肿瘤(特别是急性淋巴细胞白血病和淋巴瘤)患者极为有效，能够维持持久的治疗效果；靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的CAR-T细胞也显示出强大的抗肿瘤活性，并已获批在多发性骨髓瘤患者中进行临床使用；此外，体外扩增的自体肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)，在晚期实体肿瘤患者中显示出强大的抗肿瘤活性，特别是在患有黑色素瘤的患者中。

2023年10月，《Nature reviews clinical oncology》发布了宾夕法尼亚大学Steven M. Albelda教授撰写的题为“CAR T cell therapy for patients with solid tumours: key lessons to learn and unlearn”的综述文章，系统性地阐述了细胞治疗当前面临的困境——即CAR-T细胞在大多数实体肿瘤中的疗效仍然难以确定。Albelda教授结合自身实际经验，提出能够对抗实体瘤的CAR-T细胞的关键特征，并讨论了当前临床试验中实现这些特定特征所采取策略的合理性和可行性。同时，指出一些需要从CAR-T细胞治疗血液瘤临床试验中摒弃的教训，并汲取CAR-T细胞和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)在实体瘤中一些成功的经验。

本文根据来自一线的经验数据并结合大量相关报道，系统性地思考并阐述了当前困境，并提出较大可能获取成功的策略。

为什么CAR-T细胞在实体肿瘤中失败?

与在B细胞恶性肿瘤患者中的成功相比，CAR-T细胞在治疗实体瘤方面显得力不从心。目前我们了解到的是，临床数据表明，实体瘤患者血液中CAR-T细胞的数量通常在输注后7-14天内达到峰值，第28天时就降至较低水平。此外，实体瘤患者血液样本中检测到的CAR-T细胞数量，通常比血液瘤CD19 CAR-T细胞的数量低约五到十倍。

不幸的是，我们对为什么绝大多数CAR-T细胞在实体瘤患者中，只显示出较小的临床活性知之甚少，这是因为很少有数据使用一系列成像或输注后的活检样本评估CAR-T细胞在人体内的迁移。此外，甚至更少的研究评估了输注后从肿瘤中分离的CAR-T细胞的功能活性。

因此，对于基本问题，例如：(1) 有多少CAR-T细胞进入肿瘤；(2) 它们到达后是否会增殖或持久存在；以及(3) 它们能够保持多长时间的功能，我们还缺乏答案。没有这些关键问题的答案，很难知道在哪里以及如何进行必要的改进。

细胞治疗动物模型的进退两难

由于临床数据非常有限，对CAR-T细胞在体内活性的了解主要来自两类小鼠模型。大多数研究将人源CAR-T细胞注射到免疫缺陷的小鼠(通常是NSG小鼠)体内，这些小鼠携带的肿瘤来自人癌细胞系；另一种较少使用的方法是将鼠源CAR-T细胞(通常在清淋后)注射到免疫健全的小鼠体内，这些小鼠携带鼠的肿瘤(syngeneic tumor，主要在皮下)。

这两种模型与理想的动物模型存在差距，但研究人员目前认为，相比之下，将人T细胞注入NSG小鼠的模型更具有信息价值，因为鼠和人T细胞之间存在许多差异，使用与临床试验中相同的人源CAR-T细胞进行临床前研究将更具相关性。也有科研人员尝试使用免疫重建的人源化小鼠，即通过使用CD34+干细胞或胚胎组织，重建具有人免疫系统的免疫缺陷小鼠。然而，这种模型仍具有挑战性，包括不完全的免疫系统重建、高昂的成本、荷瘤困难、异种反应性等。

此外，细胞数量上的不一致使得从动物转化到人十分困难。当前在实体瘤小鼠模型中测试的细胞数量，通常在10^6到10^7个CAR-T细胞之间，直接推算会转化为向患者输注10^10至10^11个CAR-T细胞，这远超临床试验中使用的数量，可能使制造变得困难，并会产生毒性效应。

了解CAR-T细胞在实体肿瘤中失败的原因

CAR-T细胞在体内的转运

1)来自动物模型的结果

CAR-T细胞研究和开发中需要回答的两个基本问题是，静脉输注后T细胞去了哪里，以及它们进入肿瘤后的效果如何。因此需要借助以下两种技术：

• 肿瘤活检采样：目前已在临床前动物研究中广泛应用，但来自实体瘤患者中的活检由于患者的不适和费用，活检样本的获取受到严格的限制。

• CAR-T细胞成像：通常使用PET或单光子发射CT(SPECT)成像进行详细考察。对CAR-T细胞进行直接放射性标记，也可以实现高灵敏度的检测，但通常半衰期相对较短(<3天)，仅允许短期数据收集。对T细胞进行基因编辑，携带编码荧光酶或其他酶的基因，也是一种方法。

科研人员利用上述两种技术考察了人T细胞在NSG小鼠体内的分布，结果显示，T细胞首先在肺中积聚，在注射后的12-24小时，T细胞定位到肝脏和脾脏，有少量定位在骨髓和淋巴结。初始的肿瘤特异性摄取通常非常有限，随着时间延长(几周后)，肿瘤内CAR-T细胞的数量逐渐增加。

过继转移的小鼠CAR-T细胞在免疫健全小鼠体内的分布，与上述人CAR-T细胞在NSG小鼠体内的分布相似，不过在肿瘤内蓄积倾向于发生略早，另外，与人CAR-T细胞不同，转移的小鼠T细胞数量在注射后约7-10天达到峰值，随后细胞消失。通常不会发生像人T细胞那样，在肿瘤内增殖和CAR-T细胞数量随时间增加的情况。

总的来说，临床前数据表明，注射的CAR-T细胞最初只有很少进入肿瘤。注射到同基因小鼠中的小鼠T细胞仅持续几周，而注射到免疫缺陷小鼠体内的人CAR-T细胞似乎在数周内增殖，从而在肿瘤内积聚。

2)来自临床试验的结果

CAR-T细胞注射到实体瘤的患者体内会发生什么？一些研究报告表明与两种小鼠模型中观察到的模式相似，CAR-T细胞首先在肺和次级淋巴器官中蓄积，随后在24-48h内非常低效地转移到肿瘤中。同时，在2023年6月发表的一项在头颈鳞状细胞癌患者的研究中，使用111In标记的CAR-T细胞进行瘤内注射48小时后，未检测到全身系统的CAR-T细胞。

为什么肿瘤转运如此受限？

在T细胞穿越进入肿瘤基质过程中，周围血管细胞、细胞外基质蛋白和间质基质细胞会构成屏障，导致只有很少的数量最终进入癌细胞富集区。杀死肿瘤细胞的过程需要与肿瘤细胞上的ICAM1结合，而这个过程效率极低，只有极少数T细胞成功与肿瘤细胞相互作用。导致这种低效率的原因，包括趋化因子-CCR不匹配，粘附受体的缺陷和细胞外基质屏障(图1)等。

图1：靶向阻断CAR-T细胞的屏障

另一个重要但未被重视的问题是CAR-T细胞可能被“误导”进入淋巴组织，远离实体肿瘤。目前，CAR-T细胞的制造主要是根据CD19靶向产品在白血病和淋巴瘤患者中的数据来指导的，强调进入淋巴结和骨髓发挥抗肿瘤作用的重要性。已知表达高水平CCR7和CD62L的T细胞更倾向于转运到淋巴结或骨髓，而当前大多数生产方案的目标，是获得具有中央记忆细胞表型(CD62L高CCR7高CD45RO+)而不是效应记忆细胞表型的CAR-T细胞(图2)，后者通常不利于肿瘤的转运。

图2 ：与循环T细胞相比，CAR-T细胞产品在中枢记忆T细胞中高度富集

CAR-T细胞的持久性

在几乎所有的实体瘤试验中，血液中CAR-T细胞DNA拷贝数为每微克10^3到10^4个不等，而CAR-T细胞仅在输注后的一个月内可检测；相比之下，治疗白血病患者的靶向CD19 CAR-T细胞的大多数试验中，血液中通常可以检测到高数量的CAR-T细胞，每微克DNA通常为10^5-10^6个拷贝，其持久性通常可达数月至数年。

来自几项实体瘤患者的肿瘤活检样本数据显示，很少有一致被识别的肿瘤内CAR-T细胞，并且这些细胞通常持久性有限，不会广泛扩增。CAR-T细胞的数量在静注后的早期(7–14天)往往最高。现有的临床数据更接近于鼠源CAR-T细胞在免疫正常小鼠中的情况，而不是人源CAR-T细胞在免疫缺陷小鼠中的状况。

图3：CAR-T细胞在选定试验中的持久性

肿瘤内CAR-T细胞的功能

基于T细胞的癌症治疗的基本目的，是提供足够数量的多功能CAR-T细胞，这些细胞能够随着时间持续靶向和消除肿瘤细胞。目前的证据表明，CAR-T细胞治疗实体瘤患者的关键问题是，太少的给药细胞可以浸润肿瘤并保持功能(图4)。在人CAR-T细胞的临床前模型中，许多细胞在早期时间点具有很高的功能性，但些细胞很少位于肿瘤内部。随着肿瘤内CAR-T细胞数量的增加，它们逐渐功能减弱，导致只有一个短暂的时间窗口内有足够数量的功能良好的CAR-T细胞(图4a)，这种情况与小鼠来源CAR-T细胞的临床前模型相似(图4b)。

图4:缺乏肿瘤内功能性CAR-T细胞限制了抗肿瘤活性

肿瘤异质性和抗原扩散

与B细胞恶性肿瘤或多发性骨髓瘤不同，实体肿瘤中抗原的表达水平较低且异质性强。因此，除非CAR-T细胞诱导某种旁观者效应或抗原扩散(antigen spreading)效应，或者多个抗原被靶向，否则成功治疗的可能性较低。但当前普遍共识认为，CAR-T细胞单独并不会引起实质性的旁观者效应，尽管最初有人猜测CAR-T细胞可能具有这样的特性。

例如，在使用同基因小鼠模型的一项临床前研究中，靶向间皮素的CAR-T细胞能够完全清除由100%间皮素表达的细胞组成的肿瘤，而当肿瘤仅包含10%间皮素阴性细胞时，肿瘤便无法被完全清除，只能暂时减缓肿瘤生长。因此，大多数治疗实体瘤的CAR-T细胞临床试验，入组标准并未规定高比例的肿瘤细胞必须表达目标抗原，这是一个值得关注的问题。

从T细胞转移中能够学到的经验

倾向淋巴结转运的T细胞可能不是实体瘤的最佳选择

如前所述，目前几乎所有CAR-T细胞制备技术的目标是生产类似天然或中央记忆的细胞(图2)，这些细胞将更加倾向于迁移到淋巴结和骨髓。当应用于TILs或TCR-T时，这一策略具有很强的合理性，因为骨髓和淋巴结是表达T细胞同种肽抗原的树突状细胞(DCs)，可以呈现抗原、激活T细胞并诱导扩增成效应细胞的最佳自然环境。对于CAR-T细胞靶向血液系统癌症，在淋巴结和/或骨髓中常见的大量肿瘤细胞，这种方法似乎有助于支持CD19或BCMA靶向的CAR-T细胞的激活和增殖。

与优先迁移到外周部位的效应或效应记忆细胞相反，天然或中央记忆T细胞上CD62L和CCR7的高表达，使其优先迁移到次级淋巴结和骨髓。但实体瘤定向的CAR-T细胞旨在靶向实体瘤细胞表面表达的抗原，因此，当CAR-T细胞进入骨髓或淋巴结时，它们将不会遇到其抗原，从而不会被激活增殖或分化为效应细胞，除非肿瘤已转移到这些位置。同时，实体瘤动物模型的数据显示，效应CAR-T细胞比记忆T细胞更有效。

另外，TILs(或TCR-T)和CAR-T细胞之间的一个重要区别在于前者可以被DCs广泛激活，这可以提供最佳的共刺激信号。这种共刺激可以在淋巴结和骨髓中发生，尽管也有证据支持肿瘤内激活的DCs的重要作用。找到利用DC激活力量的方法(以增强CAR T细胞的增殖和持久性)是我们应该从TILs试验中学到的一课。

长期的持久性可能不是必要的

目前一般的共识认为，CAR-T细胞在血液瘤患者中的成功与CAR-T细胞的持久性密切相关，同时，一些TIL试验的数据表明，T细胞的持久性也与治疗反应相关。然而在实体瘤患者中，CAR-T细胞持久性的重要性尚未确定。更重要的是，实体瘤动物模型的数据表明，CAR-T细胞的持久性与逐渐增加的T细胞低功能水平相关。

面对这个难题的传统方法是继续采用血液瘤的策略，同时改进CAR-T细胞，使其更具持久性且不太容易丢失功能。然而，另一种可以考虑的方法是放弃对持久性的理解，而采用多次给药的策略输注新鲜CAR-T细胞。这样虽然注射的CAR-T细胞随时间耗竭，但是可以被新的高功能性的CAR-T细胞替换，可能有助于在更长时间内积累更多功能性的CAR-T细胞(图5)。不过为了避免多次给药时细胞的排斥，需要减少CAR成分的免疫原性。

图5，改善实体瘤患者CAR-T细胞活性的可能策略

靶向多种肿瘤抗原很重要

除了它们激活机制的差异之外，肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)和CAR-T细胞之间的另一个重要区别是前者是多克隆性的，因此可能靶向多个抗原。2022年发表的一项研究数据表明，治疗细胞识别的新表位数量与黑色素瘤患者的治疗反应之间存在相关性。这是一个应该学到的经验教训。成功的实体瘤患者CAR-T细胞疗法可能需要靶向多个肿瘤特异性抗原，最好能够触发某种旁观效应和/或诱导抗原扩散到内源性免疫系统。例如，通过工程化分泌FLT3配体的CAR-T细胞，并通过4-1BB激动促使DC的招募和激活，促进了DC的招募和激活，并在小鼠模型中导致了内源性T细胞应答的增强和抗肿瘤活性。

该领域如何才能最好地向前发展?

建议该领域的研究人员在未来的工作中考虑两种不同的优化策略，以在实体瘤患者中取得更大的成功。策略一，即该领域目前的方向，基于为血液瘤患者开发的传统“记忆细胞”模式；策略二，更具推测性，是一种较不传统的方法，采用“短寿命效应细胞”模式。

策略1:记忆细胞模式

该方法的目标是最大程度地促进CAR-T细胞的转运和持久性，同时避免CAR-T细胞的低功能性。通过对T细胞进行特定的遗传改变(通过添加额外的基因或使用基因编辑技术来抑制可能的抑制因子)，使T细胞能够“休息”，从而防止慢性刺激；或者通过直接改变TME或使用能够分泌细胞因子和/或其他蛋白质的装甲CAR-T细胞，来解决CAR-T细胞的持久性和防止低功能。这一策略面临的主要挑战是需要引入多个基因改变，这在原代T细胞中通常难以实现。通过诱导多能干细胞衍生的同种异体T细胞，进行多个基因改变来提高CAR-T细胞的迁移和持久性，可能是另一种可以选择方法。

策略2：短寿命效应细胞模式

到目前为止，在实体瘤患者中基本上无法产生大量持久、且具有功能性的CAR-T细胞，这表明需要采取其他替代方法，其中一种方法是多次注射CAR-T细胞。然而，这需要开发全人源的CAR-T细胞，因为有研究报道，患者在多次注射CAR-T后，对鼠源单链抗体片段产生了严重的免疫反应。

尽管研究尚不充分，目前一些数据支持在实体瘤小鼠模型中，更短寿命、更效应样T细胞具有优越性。例如，具有CD28–CD3ζ胞质结构域（因此更类似效应细胞）的CAR-T细胞，比4-1BB–CD3ζ具有更好的抗肿瘤活性；另外，两项比较效应细胞与记忆细胞的CAR-T细胞临床前研究，显示效应细胞的抗肿瘤活性更强。

目前，用于生产mRNA-CAR-T细胞的技术已经取得了显著的进展，包括mRNA的优化、纯化以及脂质纳米颗粒的使用。这一技术的发展避免了昂贵且耗时的体外CAR-T细胞的制备，无需淋巴耗竭，并且可能在各种医疗环境中高度适用于重复剂量给药。

CAR-T细胞在实体瘤患者身上成功试验的经验

过去几年发表的两篇研究报告(涉及策略1，即中央记忆模式)，分别为Claudin18.2和GD2 CAR-T细胞，描述了与CD19 CAR-T细胞在淋巴瘤患者中观察到的相似的疗效水平。它们的共同之处包括使用高剂量的CAR-T细胞，允许多次输注，并且两个试验中的肿瘤在大多数肿瘤细胞上都表达中度或高水平的目标抗原，且可检测到CAR的时间较长(约2个月对比2周)。然而，这些持久性水平相对于先前成功的CD19靶向CAR-T细胞试验仍然有限，表明需要进行重复输注。总体而言，这些数据支持了策略1在患有实体瘤的患者中有可能取得成功，前提是能够生成高水平的功能持久性CAR-T细胞。

结论

解决CAR-T细胞疗法在实际应用于实体瘤患者中面临的众多挑战，是一项艰巨的任务。

1. 需要获取更多有关CAR-T细胞在患者中转运、持久性和功能性的信息，同时也需要更好的T细胞成像方法以及肿瘤活检样本的协助。另外，临床前数据表明CAR-T细胞肿瘤归巢效率非常低，其在进入肿瘤后很可能迅速失去功能。

2. 需要认识当前临床前模型的优势和劣势，并适当地使用这些模型。尽管文献中测试人源CAR-T细胞在免疫缺陷小鼠中的作用占主导地位，在免疫系统完整的小鼠中使用鼠源CAR-T细胞的动物模型可能更具有临床预测性，更应经常使用。

3. 要取得治疗成功，需要共同作用多种免疫逃逸机制的策略。这些策略包括通过CAR工程进行优化，在体外T细胞扩增过程中优化条件以促进特定T细胞亚型的出现，以及通过宿主改变TME或刺激内源性T细胞。

4. 由于存在多重挑战，因此在追求传统的记忆细胞模式时，最有效的两个领域是完善使用iPSCs使多个基因改变引入异体CAR-T细胞、以及使用在淋巴结DC细胞中表达靶抗原的“疫苗”，以最大程度地促进增殖、增强持久性和增强旁观效应。

5. 目前实体瘤CAR-T细胞的临床试验是基于在血液瘤患者中成功的方法，生产具有最少效应细胞和最多记忆或记忆干细胞表型的T细胞，导致CAR-T细胞最初将被运送到骨髓和淋巴结，具有最高的长期持续性概率。这种方法可能在实体瘤患者中不是最佳的方法。另一种选择是重复给予高活性的效应细胞，因为这些细胞可以更有效地被运送到肿瘤，从而杀伤肿瘤细胞，并在失去功能时被重复给药“取代”。也可以使用mRNA转导产生的CAR，设计体内原位生成CAR-T细胞的方法尤其具有吸引力，因为可以降低成本和等待时间，提高安全性和可及性。

来源：细胞知聊